細(xì)胞醛糖還原酶(aldose reductase;AR)活性光度法定量檢測(cè)試劑盒-技術(shù)資料/價(jià)格-赫澎上海生物
細(xì)胞醛糖還原酶(aldose reductase;AR)活性光度法定量檢測(cè)試劑盒
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)
主要用途
HEPENGBIO細(xì)胞醛糖還原酶(aldose reductase;AR)活性光度法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)底物葡糖醛酸,在醛糖還原酶的催化作用下,產(chǎn)生山梨醇,伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化后峰值的降低,即采用光度法來(lái)測(cè)定樣品中酶活性的方法。其適用于各種細(xì)胞(動(dòng)物、人體、昆蟲(chóng)等)裂解懸液樣品醛糖還原酶的活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌,即到即用,操作簡(jiǎn)捷,性能穩(wěn)定。
技術(shù)背景
醛糖還原酶(aldose reductase;ALR2,EC1.1.1.21)是一種NADPH依賴(lài)性氧化還原酶,屬于醛酮還原酶(aldo-keto reductase;AKR)超級(jí)家族成員之一,催化各種醛類(lèi)和羰基化合物的還原反應(yīng),特別是葡萄糖還原為山梨醇的反應(yīng),是葡萄糖代謝中多元醇(polyols)通路的第一步反應(yīng)的關(guān)鍵限速酶。醛糖還原酶主要在人體肝組織、晶狀體、視網(wǎng)膜、雪旺氏細(xì)胞、胎盤(pán)組織和紅細(xì)胞中表達(dá)。醛糖還原酶與糖尿病并發(fā)癥相關(guān),包括白內(nèi)障、神經(jīng)病變、腎臟病變、視網(wǎng)膜病變、動(dòng)脈粥樣硬化等,由此成為藥物靶標(biāo)。基于底物葡糖醛酸(glucuronate),在醛糖還原酶的催化作用下,產(chǎn)生山梨醇(sorbitol),同時(shí)其輔酶因子還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate;β-NADPH)轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate;β-NADP),通過(guò)測(cè)定吸光值的變化(340nm 波長(zhǎng)),來(lái)定量分析醛糖還原酶的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為:
ALR2
Glucuronate + β-NADPH → sorbitol + β-NADP
產(chǎn)品內(nèi)容
HEPENGBIO清理液(Reagent A) 120毫升
HEPENGBIO裂解液(Reagent B) 10毫升
HEPENGBIO緩沖液(Reagent C) 20毫升
HEPENGBIO反應(yīng)液(Reagent D) 2毫升
HEPENGBIO底物液(Reagent E) 2毫升
HEPENGBIO陰性液(Reagent F) 500微升
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 1份
保存方式
保存在-20℃冰箱里;HEPENGBIO反應(yīng)液(Reagent D)和HEPENGBIO底物液(Reagent E)避免光照;有效保證6月
用戶(hù)自備
1.5毫升離心管:用于樣品制備和保存的容器
15毫升錐形離心管:用于樣品制備的容器
細(xì)胞刮脫棒:用于細(xì)胞脫離
(微型)臺(tái)式離心機(jī):用于樣品操作
比色皿或96孔板:用于光度的容器
分光光度儀或酶標(biāo)儀:用于樣品光度分析
實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的HEPENGBIO裂解液(Reagent B)置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。
一、 樣品準(zhǔn)備
1. 準(zhǔn)備好75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞(1至5 X 107細(xì)胞)
2. 小心加入3毫升HEPENGBIO清理液(Reagent A),覆蓋生長(zhǎng)表面
3. 小心抽去清理液
4. 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞(注意:可以使用胰酶消化)
5. 加入3毫升HEPENGBIO清理液(Reagent A),混勻細(xì)胞
6. 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管(注意:懸浮細(xì)胞從這一步驟開(kāi)始)
7. 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為300g
8. 小心抽去上清液
9. 加入500微升HEPENGBIO裂解液(Reagent B),充分混勻
10. 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
11. 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
12. 置于冰槽里孵育30分鐘
13. 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)
14. 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
15. 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)(注意:建議使用HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒)
16. 即刻放進(jìn)-70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
二、 測(cè)定準(zhǔn)備
1. 開(kāi)啟并設(shè)定好分光光度儀(溫度為25℃):波長(zhǎng)340nm,間隔2分鐘,讀數(shù)6次(共10分鐘),并置零
2. 從-20℃冰箱里取出試劑,置于冰槽里融化;HEPENGBIO底物液(Reagent E)避免光照
3. HEPENGBIO緩沖液(Reagent C)室溫下均衡溫度
三、 背景對(duì)照測(cè)定
1. 移取750微升HEPENGBIO緩沖液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入100微升HEPENGBIO反應(yīng)液(Reagent D)
3. 加入100微升HEPENGBIO底物液(Reagent E)
4. 上下傾倒數(shù)次,混勻
5. 在25℃溫度下孵育3分鐘
6. 加入50微升HEPENGBIO陰性液(Reagent F)
7. 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3秒之內(nèi))
8. 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè),此為背景空對(duì)照(0分鐘讀數(shù)-10分鐘讀數(shù))
四、 樣品測(cè)定
1. 移取750微升HEPENGBIO緩沖液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入100微升HEPENGBIO反應(yīng)液(Reagent D)
3. 加入100微升HEPENGBIO底物液(Reagent E)
4. 上下傾倒數(shù)次,混勻
5. 在25℃溫度下孵育3分鐘
6. 加入50微升待測(cè)樣品(100微克蛋白)(注意:樣品須清澈)
7. 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3秒之內(nèi))
8. 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè),此為樣品讀數(shù)(0分鐘讀數(shù)-10分鐘讀數(shù))
五、計(jì)算樣品活性
[(樣品讀數(shù)-背景讀數(shù))X樣品稀釋倍數(shù)X 1(體系容量;毫升)]÷[0.05(樣品容量;毫升)X 6.22(毫摩爾吸光系數(shù))X 1(光徑距離;厘米)X 10(反應(yīng)時(shí)間;分鐘)]=單位/毫升÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升=單位/毫克
單位=微摩爾NADPH/分鐘
六、 酶標(biāo)儀測(cè)定
1. 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記:背景對(duì)照和樣品
2. 分別移取150微升HEPENGBIO緩沖液(Reagent C)到96孔板里
3. 分別加入20微升HEPENGBIO反應(yīng)液(Reagent D)
4. 分別加入20微升HEPENGBIO底物液(Reagent E)
5. 輕輕搖動(dòng)96孔板
6. 在25℃溫度下孵育3分鐘
7. 分別加入10微升HEPENGBIO陰性液(Reagent F)或待測(cè)樣品(50微克蛋白)到相應(yīng)孔里(注意:樣品須清澈)
8. 輕輕搖動(dòng)96孔板
9. 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè):獲得0分鐘和10分鐘讀數(shù)
10. 活性計(jì)算
[(樣品讀數(shù)-背景讀數(shù))X樣品稀釋倍數(shù)X 0.20(體系容量;毫升)]÷[0.01(樣品容量;毫升)X 6.22(毫摩爾吸光系數(shù))X 0.6(光徑距離;厘米)X 10(反應(yīng)時(shí)間;分鐘)]=單位/毫升÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升=單位/毫克
單位=微摩爾NADPH/分鐘
注意事項(xiàng)
1. 本產(chǎn)品為20次(比色皿)和100次(96孔板)操作,包括背景對(duì)照
2. 操作時(shí),須戴手套
3. 系統(tǒng)操作過(guò)程中,背景測(cè)定只需1次
4. 樣品須澄清,至關(guān)重要
5. 孵育完成后即刻光度測(cè)定
6. 測(cè)定值由高到低變化;測(cè)定持續(xù)10分鐘
7. 樣本測(cè)定10分鐘讀數(shù)低于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
8. 光度測(cè)定后,比色皿須清洗徹底
9. 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為100微克/50微升(本公司提供 HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒)
10. 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低,可以調(diào)整樣品濃度
11. 醛糖還原酶單位活性定義為:在25℃,pH 6.2條件下,每分鐘內(nèi)能夠轉(zhuǎn)化1微摩爾葡糖醛酸至山梨醇所需的酶量作為一個(gè)活性單位
12. 本公司提供系列醫(yī)學(xué)生化經(jīng)典分析試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感