注意:正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。測(cè)定意義
FDA 水解反應(yīng)能很好的反應(yīng)土壤中微生物活性和土壤質(zhì)量的變化以及生態(tài)系統(tǒng)中有機(jī)質(zhì)的轉(zhuǎn)化,是土壤質(zhì)量研究中的重要生物學(xué)指標(biāo)之一。
測(cè)定原理
FDA 是一種無(wú)色化合物,在介質(zhì)中能被許多土壤酶所催化水解,并經(jīng)脫水反應(yīng),產(chǎn)生酶解終產(chǎn)物熒光素,穩(wěn)定不易被分解,并在 490nm 處有強(qiáng)吸收峰,通過(guò)檢測(cè) 490nm 處的吸光值變化可計(jì)算得FDA 水解酶活性。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器
天平、低溫離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、恒溫水浴鍋。
試劑組成和配制
標(biāo)準(zhǔn)液:液體 4mL×1 瓶,4℃保存。試劑一:液體 40mL×1 瓶,4℃保存。
試劑二:粉劑 1 瓶,-20℃避光保存,臨用前加 4mL 試劑三溶解。試劑三:液體 40mL×1 瓶,4℃保存。
樣本處理
稱取風(fēng)干過(guò) 30-50 目篩土壤約 0.1g,備用。
測(cè)定操作表
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空白管 |
標(biāo)準(zhǔn)管 |
對(duì)照管 |
測(cè)定管 |
樣本(g) |
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0.05 |
0.05 |
標(biāo)準(zhǔn)液(μL) |
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40 |
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雙蒸水(μL) |
40 |
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試劑一(μL) |
200 |
200 |
240 |
200 |
試劑二(μL) |
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40 |
充分混勻,30℃,震蕩 1h |
試劑三(μL) |
160 |
160 |
160 |
160 |
10000g,25℃,離心 5min,取 200μL 上清于微量石英比色皿/96 孔板中測(cè)定 490nm 處吸
光值A(chǔ),△A1=A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管,△A2=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管 |
注意:空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)定一次。酶活性計(jì)算公式
a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
酶活性定義:每克土壤每天產(chǎn)生 1μmol 熒光素的量為一個(gè)酶活力單位。
S-FDA 活性(μmol/d/g 土樣)=(△A2÷△A1×C 標(biāo)準(zhǔn)品)×V 反總÷W
= 0.96×(△A2÷△A1)÷W
b. 用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
酶活性定義:每克土壤每天產(chǎn)生 1μmol 熒光素的量為一個(gè)酶活力單位。
S-FDA 活性(μmol/d/g 土樣)=(△A2÷△A1×C 標(biāo)準(zhǔn)品)×V 反總÷W
= 0.96×(△A2÷△A1)÷W
C 標(biāo)準(zhǔn)品:標(biāo)準(zhǔn)品濃度 100μmol/L;V 反總:反應(yīng)總體積,0.4mL;W:樣本質(zhì)量,g